液相吃瓜91
柱的洗濯
转自丁香园
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是迄今在高效液相吃瓜91
中操纵*普遍的手艺，首要是因为它合用于阐发极大大都的非极性物资和良多的可离子化的及离子化合物。大大都用于反相吃瓜91
的牢固相都是自然的疏水物资，是以，阐发物是根据它们与牢固相的疏水彼此感化的巨细来分手的，含有疏水的机制也能以一样的保留体例分手。
牢固相上另有多数物资，如夹杂相（比方苯基-己基）、结尾封锁和非结尾封锁品种和极性嵌入相也存在于这些键合硅胶上。另有良多填料用于反相吃瓜91
，包含聚合物，聚合物外表涂上硅胶和氧化铝，无机-无机夹杂物，涂层氧化锆，和石墨化碳。差别品种的牢固相有他们本身的长处和错误谬误。
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柱操纵各类活动相和增添物能够有良多的操纵。一些手艺操纵增添物能够转变或润色填料的外表。偶然候这些增添物有能够会净化键合相外表。
硅胶外表因为有着疏水键合相而有一些别的化学性子。残留的硅烷醇存在于一切的硅胶键合填猜中。这些硅烷醇具备弱酸性，是以能与某些待阐发物合基质成份，出格是碱性成份。因为硅烷醇的pKa值约莫是4.5，离子化能在中性pH前提下发生是以与阳离子发生静电彼此感化就有能够发生。较老的A型硅胶能包容高浓度金属离子（偶然候100ppm或更多），而这能使硅胶外表的酸性更大乃至能发生金属鳌合景象或**一些化合物。残留硅烷醇在非结尾封锁的硅胶合短链键合相如C2或C4上更让人懊恼。
操纵者必须清晰他们所用的牢固相外表特别性子和能够的阐发物-牢固相外表的彼此感化，如许当他们操纵反相方式时能力斟酌到能够的基质彼此感化。比方，很是疏水的样品基质如玉米油，高芬芳物资，和蜡能粘住牢固相装填外表并且转变他们的性子。含有卵白质物资的生物流体也能吸附在装填外表。虽然阐发者想尽*大尽力来掩护HPLC柱子，某些阐发物-基质净化能使牢固相遭到无害的影响。
当柱子被净化，它的吃瓜91
行动和没被净化的柱子会有些差别。被净化的柱子能发生反压题目。
被净化的反相柱子必须洗濯和再生能力规复本来的操纵前提。这局部的“柱子察看”将会商可行的方式使柱子答复本来的或差未几本来的状况。因为键合硅胶柱子是*受接待的，我重点报告这类柱子。*后，我将会商别的反相柱子的洁净步骤。
甚么致使反相柱子净化发生？凡是，样品中含有一些对阐发者来讲不感乐趣的工具。盐、脂质、含脂物资、腐质酸、疏水卵白质和别的一些生物物资是一些能够在操纵时与HPLC柱发生彼此感化的物资。这些物资有比阐发者的方针物或少或大的保留值。那些保留值较小的物资如盐类普通来讲在空体积时就被冲出吃瓜91
柱。这些非方针产品的搅扰能被检测器检测到并且能构成吃瓜91
峰，气泡，基线上移或是负峰。若是样品成份在柱子中有很强的保留并且活动相溶液成份缺乏以把这些物资洗脱上去，屡次上样后，这些吸附在柱子外表的物资凡是就会堆集在柱头。这些行动凡是只要经由进程平行尝试能力发明。有着中等保留值的样品能被迟缓洗出并且表现为宽峰，基线扰动，或基线漂移。
偶然候这些被吸附的样品成份积累到必然水平足以使他们起头构成新的牢固相。阐发物能与这些杂质感化构成必然的分手机理。保留时辰会动摇，拖尾会呈现。若是充足的净化发生，柱子的反压能逾越泵所能蒙受的*大压力，使柱子没法任务和在梗塞处发生空体积。
再生被净化HPLC柱子的关头是晓得净化物的性子并且能找到恰当的溶剂来去除。若是净化是因为反复进样时强保留物资的积累引发的，操纵简略的步骤来撤除这些净化物常常能规复其吃瓜91
行动。偶然候，颠末屡次操纵今后的吃瓜91
柱用90～100%的溶剂B（双溶剂反相体系中较强的溶剂）冲刷20个别积能够**净化物。比方，柱子中残留的脂质就能用非水溶剂如甲醇、乙晴、四氢呋喃。若是你操纵的是缓冲液体系，不要间接切换到强溶剂，俄然转换到高浓度无机溶剂能够会使HPLC活动体系中的缓冲液积淀，如许会致使更大的题目如柱头梗塞、管道梗塞、泵泄露、活塞毁伤或进样阀转轴失灵。应当先用无缓冲活动相（即把缓冲液换成水）。冲刷5～10个别积今后才改换强溶剂。
偶然候，强溶剂也没法把残留在吃瓜91
柱上的净化物洗掉。那末更强的溶剂或是一系列溶剂就有须要用来洗濯柱子乐，若是净化物长短生物物资，操纵者能够跳过一个或多个别的的无机溶剂去除净化物。溶剂与溶剂之间的组合有良多。到柱子厂家的网页上能找到保举的溶剂体系。
普通来讲，一切的洗濯方式都有近似的情势。所用的溶剂都是随溶剂强度增添，常常*后一个溶剂是很是疏水的（如醋酸乙酯乃至是烃），能够用来消融非极性物资如脂质和油类。咱们必须保障一系列溶剂中每个溶剂都能与下一个溶剂互混。洗濯进程要竣事时，必须借助一个中等强度能互混的溶剂而回到原始溶剂体系。比方，异丙醇是一个很是好的作为中心步骤的溶剂，因为它能与正己烷或二氯甲烷互溶又能与水相溶剂互溶。可是异丙醇粘度很是大，必须确保较低的流速以防止使泵压太高。固然，若是操纵紫外检测器的话，防止溶剂在紫外地区有接收，要不然需操纵大批的溶剂冲刷能力使基线安稳。
对典范的硅胶键合柱来讲若是不缓冲溶液的话保举操纵以下溶剂系列：
100%甲醇
100%乙晴
75%乙晴-25%异丙醇
100%异丙醇
100%二氯甲烷
100%正己烷
用二氯甲烷或正己烷今后，因为溶剂相容性柱子必须用异丙醇冲刷后能力用本来的水相溶剂。每种溶剂最少冲刷10个柱体积。如250mm×4.6mmHPLC阐发柱，阐发者能够用1～2ml/min的流速来冲刷，要答复本来的溶剂体系，不须要每步都冲刷，能够跳过中心步骤。中心步骤保举操纵异丙醇，而后用不缓冲的活动相，*后答复肇端活动相配置。四氢呋喃是别的一种比拟受接待的去除净化的溶剂。若是操纵者思疑柱子被严峻净化，能够二甲基亚砜（DMSO）或二甲基甲酰铵和水按50：50的比例夹杂用低于0.5ml/min的流速流过吃瓜91
柱。胜利再生反相柱子是一个很是耗时辰的进程，溶剂冲刷能够操纵梯度体系留宿操纵。